诺奖得主 Jennifer Doudna 团队，再发顶刊 Science。
他们实现了“超越自然演化”的 AI 蛋白质设计，创造出的新型基因编辑蛋白SynTnpB 部分变体活性达到甚至超过了天然酶。
论文链接：http://www.science.org/doi/10.1126/science.aed6123
冷冻电镜结果进一步揭示，这些工程化蛋白质在不同构象下于 RNA-DNA 界面形成了新的稳定相互作用。这也是首次通过实验确定 AI 设计的 RNA 引导核酸酶的结构。
研究团队表示，结合生成式生物学和从头设计方法，未来有望突破自然序列界限，扩展这类蛋白的功能和可设计空间。
超越自然的AI蛋白质设计
目前，CRISPR-Cas 技术已能精准编辑 DNA/RNA，但要设计出自然界不存在、且仍有活性的 RNA 引导核酸酶，绝非易事。现有序列模型生成的酶往往接近天然序列；结构引导设计虽能探索更大序列空间，却仍难在大幅改写序列的同时保留活性。
不同于此前基于序列的生物语言模型，Doudna 团队提出了一种结合结构与进化信息的 AI 蛋白设计策略，用于生成序列高度分化、但仍保留活性的 RNA 引导核酸酶。
为验证这一策略，他们选择小型 RNA 引导核酸酶 TnpB 作为设计对象。具体流程如下：
1.设计模块：生成新的 TnpB 序列
他们先采用ESM 逆折叠模型（ESM-IF1）根据 TnpB 三维结构生成候选序列。AI 生成的序列能保留 TnpB 的整体折叠和 RuvC 结构域的 DED 催化三联体，但也会改动部分 RNA/DNA 识别残基。
针对这一问题，他们基于进化信息构建序列掩码：位置保守性（Ci）或与核酸序列的共同进化耦合强度（σi）高于设定阈值的残基被固定为野生型，其余位置则交由 ESM-IF1 重新设计。
图｜使用 ESM Inverse Folding（ESM-IF1）模型进行 RNA 引导核酸酶 TnpB 设计的策略。
2.筛选模块：鉴定具有活性的变体
完成序列设计后，他们用细菌 ccdB 毒素系统筛选活性变体：能切割毒素质粒的 TnpB 变体可使细菌存活。由于仅用 Ci 约束的全长设计活性有限，他们拆分测试了 TnpB 的两个结构域：REC 主要参与 DNA 识别，NUC 与 RNA 结合和催化相关。结果显示，NUC 更耐受序列变化。基于此，他们采用 Ci/σi 双条件约束组合在 1980 个 REC-NUC 组合中筛出 9 个高活性、高多样性的变体。
图｜筛选基于位置保守性（Ci）和耦合强度（σi）阈值条件化生成的 AI 变体SynTnpB。
活性超越天然酶
整体来看，AI 设计的 SynTnpB 变体在细菌、植物和人类细胞中保留了活性，甚至超过天然酶。冷冻电镜结构进一步显示，这些 AI 设计变体能在不同构象状态下稳定 RNA-DNA 界面。具体结果如下：
1.人类和植物细胞编辑
筛选得到的变体在人类和植物细胞中均保留编辑活性，部分超过天然酶。他们将 9个变体放入 HEK293T 细胞和拟南芥原生质体验证。在人类细胞中，多数变体活性与野生型相当，v1 和 v5 表现最佳，最高编辑率达到 50%，约为野生型的 1.8 倍。植物细胞实验中，v1 同样在多数测试靶点上优于野生型。
图｜AI 生成的 TnpB 在 HEK293T 细胞中的基因组编辑。
2.特异性和生化表征
从特异性来看，SynTnpB 变体保留了典型 TTGAT TAM 偏好，但脱靶表现因变体而异。全基因组 Tn5 标签化分析显示，v1 的特异性与野生型相当，v5 和 v7 检测到更多脱靶位点。
从表达和生化表征来看，编辑活性差异不能简单归因于表达水平。Western blot 结果显示，各变体表达水平与编辑活性不相关。以 v7 变体为例，其热稳定性与野生型相当，并保留较强的靶链切割活性，但切割反应较野生型有所减慢。
3.冷冻电镜结构
结果显示，AI 生成的残基在多个结构域与 RNA-DNA 形成新接触，稳定不同构象状态下的界面。此外，他们还捕获到此前未在 TnpB 中报道过的 TAM 结合构象中间态。
他们选择序列分化程度较高的 v7 进行冷冻电镜解析。该变体与野生型序列一致性为77%，并在 RUNX1 位点显示较高编辑效率。实验显示，冷冻电镜结构分辨率达到 2.8 Å，并捕获到 TAM 结合状态和 R-loop 形成状态两种构象。
TAM 结合状态中，蛋白和 RNA 构象与 ISDra2 TnpB 二元复合物相似，同时结合了 DNA，并在异源双链种子区形成单碱基配对。AI 生成的 N4R 残基与保守的“磷酸锁”残基 K84 共同稳定这一配对。该构象中间体此前未在 TnpB 中观察到。
R-loop 形成状态中，reRNA 和靶 DNA 已经形成较完整的配对结构。此时，AI 生成的残基分布在 REC、NUC 和 lid 等区域，与这段 RNA-DNA 双链形成接触；同时，桥接螺旋仍保留有助于双链形成的弯折运动。
图｜AI 生成变体 v7 的冷冻电镜结构揭示了 RNA-DNA 界面残基和保守的构象运动。
不足和未来发展
不过，他们也表示，虽然当前方法有望推广到更多 RNA 引导核酸酶及其他动态核酸结合蛋白，但有几点不足。
例如，在设计目标方面，TnpB 不同结构域对序列改变的耐受性并不相同，DNA 识别相关的 REC 结构域对替换更敏感，而 RNA 结合和催化相关的 NUC 结构域更能耐受变化。未来，他们仍需进一步检验模块化设计原则是否适用于其他多结构域蛋白。
同时，在数据条件方面，序列掩码依赖足够丰富的进化信息，对数据库中序列的多样性和代表性要求较高。更丰富、更均衡的蛋白-核酸配对数据，有助于将这一方法推广到其他多状态蛋白或核酸结合蛋白。
此外，在机制理解方面，AI 生成残基如何影响核酸结合和构象变化，仍需要进一步研究。他们表示，该研究的冷冻电镜结构捕获到此前未报道的 TAM 结合状态，可能代表一种动力学中间体，也为未来研究 RNA 引导核酸酶的瞬时构象提供了先例。
更多技术细节，详见原论文。